¿Qué es la prueba de PCR? ¿Por qué es el método más confiable para detectar COVID-19?
August 17, 2021
En el pasado los diagnósticos se limitaban a lo que podía observar un médico tratante con sus propios sentidos. Como era de esperar, esto dio como resultado niveles muy variables de atención al paciente, pruebas y tratamientos no convencionales. Afortunadamente, la era moderna ha experimentado grandes avances en el área de la biología molecular y, por extensión, en el diagnóstico médico. Hoy tenemos pruebas definitivas para muchas afecciones y enfermedades que van desde la infertilidad hasta el cáncer. Recientemente el mundo ha visto una gran necesidad de contar con un método rápido para determinar si un sujeto es positivo para COVID-19. Los métodos más utilizados en la actualidad para diagnosticar dicha enfermedad son las pruebas de antígenos y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Prueba de antígenos
Es probable que la prueba de antígenos más común sea bastante familiar para la mayoría ya que se parece a una prueba de embarazo. Las pruebas de antígeno COVID-19 funcionan de la misma manera y se basan en la unión específica de un antígeno (una proteína que de la superficie del virus) en la muestra a los anticuerpos (también proteínas, generalmente de origen animal) inmovilizados en los lugares donde aparecen las líneas indicadoras. Para facilitar la detección, anticuerpos secundarios también se unen al antígeno y emiten fluorescencia o cambian de color en respuesta. El nivel de cambio de color o fluorescencia también se puede utilizar para cuantificar el nivel de antígeno presente en la muestra. En estas pruebas la muestra proviene del tracto respiratorio superior del paciente y se obtiene generalmente a través de un hisopo orofaríngeo o nasofaríngeo.
Prueba de PCR
La prueba de PCR produce millones de copias de una secuencia o secuencias específicas en el material genético presente en la muestra, lo que permite la detección de una carga viral inicial mucho más baja. Estas secuencias copiadas se pueden utilizar para diagnosticar a un paciente, ya sea por su presencia (positivo) o ausencia (negativo). En el caso del COVID-19 el material genético de partida está compuesto por ácido ribonucleico (ARN), que es relativamente frágil en comparación al ácido desoxirribonucleico (ADN), que es mucho más estable. Esta prueba solo se puede realizar en ADN, por lo cual se debe realizar una conversión del ARN de partida a ADN, lo cual se logra mediante el uso de una enzima llamada transcriptasa inversa, que hace una copia del ARN a partir de ADN. Una vez que se ha obtenido el ADN complementario (ADNc) se puede proceder con la PCR. Los componentes principales de este ensayo son la ADN polimerasa Taq, la plantilla o molde de ADN, los cebadores y nucleótidos sueltos en forma de desoxinucleósido trifosfato (dNTP). La polimerasa se puede comparar con una pieza de maquinaria cuyo trabajo es ensamblar nuevos segmentos de ADN.
Como toda pieza de maquinaria, la polimerasa requiere instrucciones tales como por dónde empezar y la secuencia de la nueva hebra. El molde es el fragmento de ADNc creado a partir de la muestra y proporciona la secuencia de la nueva hebra. A la mayoría nos es familiar el modelo de doble hélice del ADN, que da una buena idea de su estructura. El ADN está compuesto por dos hebras complementarias de nucleótidos enlazados en pares apareados de A / T y C / G. Por tanto, si está presente una hebra, la polimerasa puede producir la hebra opuesta. Los cebadores dan los puntos de inicio y son segmentos cortos de ADN con la secuencia opuesta de pares de bases en la hebra molde al comienzo del segmento de interés. Finalmente, los dNTP pueden considerarse el combustible. Son nucleótidos simples que la polimerasa une en el producto final. El proceso real de la PCR implica calentar y enfriar la mezcla para separar secuencialmente las hebras complementarias, adherir los cebadores y finalmente permitir que la polimerasa replique el segmento de interés. Al repetir este proceso la hebra original se amplifica exponencialmente.
Estos ciclos se realizaban originalmente de forma manual moviendo las muestras de un baño de agua a otro, aunque afortunadamente este proceso se ha automatizado. En promedio, en las pruebas de PCR se realizan 40 de estos ciclos, creando más de un billón de copias de la hebra inicial. Esta enorme cantidad de amplificación permite la detección del virus en concentraciones extremadamente bajas, con lo cual se obtiene un alto grado de precisión en la detección con cantidades muy pequeñas de muestra inicial. La detección propiamente dicha se logra mediante el uso de marcadores fluorescentes unidos a una sonda en un proceso conocido como PCR cuantitativa o qPCR. Esta sonda es otro segmento corto de ADN complementario que se adhiere a la hebra molde y se rompe cuando se realiza la copia. Cuando esto sucede el marcador emite fluorescencia. Cuando el nivel de fluorescencia alcanza el punto en que es detectable se ha alcanzado el umbral del ciclo (Ct) y se puede utilizar para calcular la concentración de la hebra molde original en la muestra.
El siguiente video ilustra de manera gráfica el proceso antes descrito de detección de COVID-19 por PCR de transcripción inversa en tiempo real (RT-qPCR):
¿Por qué elegir la PCR en lugar de la prueba de antígenos?
En teoría, solo se requiere una copia del ADN que se está estudiando para la detección ya que se amplifica millones de veces. Las pruebas de antígenos requieren la presencia de miles de viriones en la muestra para tener un resultado positivo. Esto es perjudicial para la detección temprana, especialmente en casos asintomáticos ya que a menudo la carga viral en la muestra será demasiado baja para registrarla correctamente, lo que conduce a falsos negativos.
Las pruebas positivas falsas también son más probables con las pruebas basadas en antígenos. Esto se debe al hecho de que las especies virales relacionadas pueden unirse en lugar del virus SARS-CoV-2, provocando así el cambio de color o fluorescencia. Un resultado falso positivo de una prueba puede ser una experiencia traumática, que posiblemente resulte en daños económicos, psicológicos e incluso físicos. Se deben hacer todos los esfuerzos posibles para garantizar que todos los resultados positivos de la prueba sean precisos para evitar angustias innecesarias.estra será demasiado baja para registrarla correctamente, lo que conduce a falsos negativos.
Consideraciones finales
La política actual en muchos países establece que cualquier prueba rápida de antígeno positiva debe confirmarse mediante una prueba de PCR posterior. Aunque puede tomar un poco más de tiempo obtener los resultados, la seguridad de la sensibilidad más alta de la prueba PCR brinda una tranquilidad que no se obtiene con la prueba de antígeno. Los kits para RT-qPCR basados en saliva de Norgen Biotek proporcionan pruebas de COVID-19 asequibles, rápidas y precisas tanto para empresas como para particulares. Simplemente se requiere que el individuo escupa en un tubo, agregue el conservante provisto en el kit y lo envíe para su procesamiento y análisis. La confiabilidad de los kits de Norgen Biotek es tal que incluso sirven actualmente como centro oficial de testeo de COVID-19 en Canada, sede de esta compañía.
Para ver cómo se lleva a cabo todo el proceso de PCR en un laboratorio revisa el tutorial de detección de COVID-19 por RT-qPCR de Norgen Biotek:
