octubre 30, 2019

En esta revisión encontrará todo lo que necesita saber para elegir la mejor proteína fluorescente para imágenes biológicas.
Desde que el gen original de la proteína verde fluorescente (GFP) se clonó en 1992, ha habido una explosión en la variedad de proteínas fluorescentes (PF) disponibles. Pueden fusionarse con una proteína en células o animales transgénicos, conjugarse con un anticuerpo o incluso usarse como sustrato en reacciones enzimáticas. Antes de seleccionar una proteína fluorescente para cualquiera de estas aplicaciones, hay una serie de consideraciones clave a tener en cuenta:

Proteína Fusión Consideración
Fusión C-terminal VS. N-terminal Pruebe ambos si es posible; Las proteínas de fusión C-terminales son generalmente mejores. Confirmar localización con un anticuerpo.
Excitación y Emisión Asegúrese de tener láseres correctos para excitar, y que los picos de emisión no se superpongan.
Brillo Seleccione la PF más brillante que también cumpla con sus requisitos experimentales.
Maduración Seleccione una maduración corta para eventos rápidos/sensibles en el tiempo.
Blanqueamiento Elija una PF con una alta fotoestabilidad para experimentos con una larga duración.
Condiciones Ambientales Asegúrese de que el pH, la temperatura y el oxígeno estén optimizados para su PF.
Optimización de Codones Compruebe que la secuencia de codones de su PF está optimizada/adecuada para su especie, especialmente cuando se usan plásmidos más antiguos.
Oligomerización En general, intente usar una PF monomérica.

Para ver las propiedades de algunas de las proteínas fluorescentes más populares, eche un vistazo a la tarjeta de referencia rápida de Abcam.

Figura 1. Espectro de Emisión.


C vs N: ¿qué terminal?

Si elige fusionar su PF al terminal C o N de su proteína de interés, la elección de cuál extremo usar dependerá en gran medida de la proteína en sí misma. Se debe evaluar cómo se pliega y si el extremo que elija tiene un requisito funcional o no. Por ejemplo, si el extremo C-terminal está plegado dentro de la proteína, es poco probable que reciba ninguna señal de la PF; o si su proteína se escinde postraduccionalmente en el extremo al que se fusiona su PF, entonces su PF se eliminará de su proteína de interés.
Si tiene los recursos o si su experimento es novedoso, podría ser mejor clonar ambos extremos con etiquetas C y N terminales para determinar la mejor opción. Un grupo de investigación descubrió que más proteínas de fusión C-terminales se localizan en el compartimento subcelular previsto que las proteínas de fusión N-terminal. Sin embargo, es importante enfatizar que, si bien las proteínas marcadas con C-terminal tienden a localizarse y comportarse como se espera, esto no siempre es posible de predecir.
Debe confirmar la localización de la proteína de fusión utilizando un anticuerpo contra la proteína nativa. Se puede emplear inmunofluorescencia verificar que la proteína de fusión se localice correctamente; una inmunotransferencia le ayudará a confirmar que la proteína de fusión tenga el tamaño correcto y se exprese a los niveles esperados; y la coinmunoprecipitación puede ayudar a evaluar cómo interactúa la proteína de fusión con sustratos conocidos.

Excitación, Emisión y Brillo

Si planea usar múltiples PF, es importante elegir una PF con picos de emisión distintos, así como picos de excitación a los que pueda apuntar con sus láseres disponibles. Si los picos de emisión se superponen, será difícil, o posiblemente imposible, diferenciarlos.
Por lo general, se desea la PF más brillante dentro de sus espectros disponibles para lograr una señal clara y superar cualquier posible fluorescencia de fondo. Los valores de brillo son un producto del coeficiente de extinción de la proteína y el rendimiento cuántico. Sin embargo, el número resultante puede ser difícil de interpretar, por lo que el brillo de una PF en relación con una PF bien definida como EGFP es una medida alternativa común.

Maduración y Blanqueo

La maduración define cuánto tiempo lleva plegarse correctamente una PF, formar el cromóforo y comenzar a fluorescer. Para eventos sensibles al tiempo en células vivas, un tiempo de maduración corto puede ser importante. Superfolder GFP (sfGFP), por ejemplo, puede plegarse en menos de 10 minutos, mientras que mOrange2 puede tomar más de cuatro horas.
El blanqueamiento es una medida de la fotoestabilidad, es decir, cuánto tiempo después de la excitación el cromóforo pierde la capacidad de emitir luz. Si planea realizar largos experimentos de lapso de tiempo, considere una PF con una alta fotoestabilidad. El zafiro T tiene una vida media de blanqueo (t½; tiempo para que una tasa de emisión inicial de x fotones/s se reduzca a la mitad) de 25 segundos, pero EGFP es mucho más estable, con un t½ de blanqueo de 174 segundos.

Condiciones Ambientales

Como la mayoría de las proteínas, las PF se ven afectados por el pH, la temperatura y los niveles de oxígeno. Dependiendo del entorno en el que planee usar su PF, es posible que necesite ajustar ligeramente las condiciones o seleccionar una PF más apropiada.
El pH puede afectar los picos de excitación y emisión, y la mayoría de las PF son sensibles al ácido. Algunas PF pueden cambiar la intensidad fluorescente con los cambios de pH. El valor de pKa es un buen indicador de la sensibilidad al pH: muestra el pH al que la mitad de los cromóforos son fluorescentes.
Los niveles de temperatura y oxígeno afectan los tiempos de maduración: las condiciones hipóxicas tienden a retrasar los tiempos de maduración, al igual que las temperaturas fuera del rango óptimo de las PF (por ejemplo, EGFP ha sido optimizado para trabajar a 37°C). Sin embargo, las PF más nuevas como UnaG, una GFP aislada de la anguila japonesa de agua dulce (Anguilla japonica), fluoresce incluso cuando los niveles de oxígeno son bajos.

Optimización de Codones

Como la mayoría de las PF se derivan de las medusas o las proteínas de coral, en lugar de células y/o tejidos de mamíferos en los que es probable que los use, puede haber una diferencia entre especies en los codones de aminoácidos utilizados. Esto puede conducir a una pobre expresión de la PF y, por lo tanto, baja señal.
Afortunadamente, muchas de las versiones más nuevas de las PF se han optimizado con codones para reflejar las preferencias de las células de mamíferos. En GFP, por ejemplo, Jürgen Haas y sus colegas mejoraron la señal entre 40 y 120 veces modificando la secuencia del codón GFP. Si está utilizando un plásmido más antiguo para generar sus proteínas de fusión, es posible que no contenga una secuencia modificada para la PF. Verifique si su secuencia de la PF se ha modificado para usar en una especie determinada.

Oligomerización

Es importante determinar si su PF es un monómero o dímero (los monómeros generalmente se denotan con una "m" que antepone el nombre de la proteína, por ejemplo, mCherry), y si esto afecta o no a su experimento. Muchos de las primeras PF eran propensas a formar oligómeros, y la oligomerización puede afectar la función biológica de la proteína de fusión. EGFP, por ejemplo, es un monómero que puede formar dímeros cuando se usa en concentraciones suficientemente altas, lo que puede distorsionar los orgánulos subcelulares o interrumpir experimentos.


Adaptación del artículo original publicado en la web de abcam


Fabiola Mejias

 Fabiola Mejias

  Representante de Allscience