Como encontrar el anticuerpo primario o secundario más adecuado para tus experimentos
febrero 27, 2020
La escogencia de los anticuerpos correctos es un paso determinante en el éxito o no de todo inmunoensayo. Es por ello que a continuación presentamos una serie de pautas importantes a tener en cuenta a la hora de seleccionar los anticuerpos adecuados para llevar a cabo exitosamente tus ensayos.
Aplicación
Las hojas de datos (datasheets) de los anticuerpos detallan las aplicaciones o técnicas en las cuales estos han sido probados con éxito. Adicionalmente, cuando un anticuerpo es probado en una aplicación y no se obtienen los resultados deseados esta información usualmente también es incluida para prevenir a los investigadores que puedan estar interesados en emplearlo de la misma manera. Por otra parte, si una aplicación no está incluida en la lista de técnicas ensayadas esto significa que el anticuerpo en cuestión no ha sido probado en dicha técnica y que no se sabe con certeza cuál será el desempeño del mismo en esa aplicación.
La naturaleza de la muestra en estudio determinará cual es el anticuerpo apropiado para cada caso. En ese sentido los siguientes aspectos deben ser tenidos en cuenta:
La región de la proteína que se desea detectar: Los anticuerpos se generan inmunizando animales huéspedes con una sustancia inmunogénica, pudiendo ser estas sustancias, conocidas como inmunógenos, proteínas completas, fragmentos de proteínas, péptidos, organismos completos (por ejemplo, bacterias) o células. El inmunógeno se describe generalmente en la hoja de datos, aunque en algunos casos no se proporciona una descripción exacta del mismo por razones de derechos de patente. De cualquier manera, es importante verificar que el inmunógeno sea idéntico o esté contenido dentro de la región de la proteína que se está tratando de detectar. Por ejemplo, si está intentando detectar una proteína de la superficie celular en células vivas mediante FACS (Fluorescence-activated cell sorting), conviene elegir un anticuerpo generado contra un dominio extracelular de la proteína de interés.
Nota: FACS es un tipo especializado de citometría de flujo que permite clasificar una mezcla heterogénea de células en dos o más recipientes, una célula a la vez, en función de la dispersión de luz específica y las características fluorescentes de cada célula.
Procesamiento de la muestra: Algunos anticuerpos requieren que las muestras se traten de manera específica. Muchos anticuerpos solo reconocerán proteínas que han sido reducidas y desnaturalizadas, porque esto revela epítopes que de otro modo serían obstaculizadas por la estructura secundaria y terciaria de las proteínas. Por otro lado, algunos anticuerpos solo reconocerán epítopes en proteínas en su estado nativo plegado. Por ejemplo, los anticuerpos de Abcam para Western Blot requieren que las muestras se reduzcan y desnaturalicen a menos que se indique lo contrario en la hoja de datos.
Para inmunohistoquímica algunos anticuerpos solo son apropiados para tejidos congelados no fijados, mientras que otros no pueden unirse a sus objetivos en tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina sin un paso previo de recuperación de antígeno que invierta los enlaces cruzados introducidos por la fijación en formalina.
Especie de la muestra
De ser posible, es recomendable escoger un anticuerpo que haya sido generado contra la misma especie de la cual proviene la muestra en estudio. El anticuerpo puede reaccionar con la misma proteína objetivo de otras especies que compartan suficiente homología de secuencia de aminoácidos. Si la muestra no es de una de las especies mencionadas en la hoja de datos, esto significa que la misma no ha sido analizada y no se puede demostrar su idoneidad. Muchas veces se realiza una predicción de reactividad cruzada basada en la similitud de secuencia y se coloca esta información en la hoja de datos, haciendo la salvedad de que es sólo una predicción.
Elección de la especie hospedera del anticuerpo primario
La especie en la que se genera un anticuerpo primario debe ser diferente de la especie de la muestra en estudio, esto con la finalidad de evitar la reactividad cruzada del anticuerpo secundario anti-inmunoglobulina con las inmunoglobulinas endógenas en la muestra. Por ejemplo, si se está estudiando una proteína de ratón, es recomendable elegir un anticuerpo primario generado en una especie distinta al ratón. Un anticuerpo primario producido en conejo sería una elección apropiada en este ejemplo, seguido de un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo.
Para técnicas que usan muestras que no contienen inmunoglobulina endógena (IgG), la elección de la especie huésped del anticuerpo primario es menos crítica. Un ejemplo es la realización de Western blot de un lisado celular que no se espera que contenga IgG. Sin embargo, los lisados de tejidos y los sobrenadantes de cultivo de tejidos que contienen suero contendrán inmunoglobulinas. La IgG aparecerá en las transferencias Western blot de muestras desnaturalizadas reducidas como bandas de 50 y 25 kDa correspondientes a las cadenas pesada y ligera de la molécula de IgG.
Elección del anticuerpo secundario adecuado
Los anticuerpos secundarios deben seleccionarse contra la especie huésped del anticuerpo primario que se esté usando. Por ejemplo, si el primario es un monoclonal generado en ratón se necesitará un secundario anti-ratón. Es recomendable consultar la hoja de datos del anticuerpo secundario para asegurarse de que haya sido probado en la aplicación que se utilizará. Este tópico será discutido a profundidad en un próximo artículo.
Elección de anticuerpos para tinción doble
La inmunotinción doble de cultivos celulares o tejidos requiere que los anticuerpos primarios se generen en diferentes especies y que los anticuerpos secundarios reconozcan una de las especies exclusivamente. Abcam ofrece una amplia gama de anticuerpos secundarios anti-Ig que han sido preabsorbidos contra las inmunoglobulinas de otras especies para eliminar la reactividad cruzada. Alternativamente también ofrecen anticuerpos primarios directamente conjugados que eliminan la necesidad de anticuerpos secundarios.
Elección de la conjugación adecuada con fluorocromos y cromógenos
Ciertas moléculas, conocidas comúnmente como etiquetas, se conjugan con anticuerpos para visualizar la presencia de la proteína objetivo. La elección de la etiqueta adecuada depende de la aplicación que se vaya a utilizar:
Las etiquetas fluorescentes emiten luz en el rango visual cuando son excitadas por la luz de una longitud de onda específica. Hay varias disponibles, todas con sus propias características de excitación y emisión.
Las etiquetas enzimáticas peroxidasa de rábano picante (HRP) y fosfatasa alcalina (AP) forman un precipitado coloreado cuando se combinan con el sustrato apropiado.
• Los anticuerpos biotinilados son útiles para la amplificación de la señal cuando son seguidos por un complejo de avidina-biotina-enzima o fluorocromo (comúnmente abreviado como reactivo ABC), o avidina o estreptavidina conjugada con una enzima o fluorocromo.
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