junho 28, 2019

Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Este método permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad del Western Blot se logra mediante el uso de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés.
Básicamente, las transferencias de Western son herramientas útiles en cualquier momento en que le gustaría obtener información sobre la expresión de proteínas en sus muestras. Se puede usar para indicar si la muestra expresa la proteína de interés o para realizar comparaciones cuantitativas de los niveles de proteína entre diferentes muestras o grupos de tratamiento. Es muy útil para validar la especificidad de un anticuerpo si su objetivo final es usarlo en inmunohistoquímica, o inmunocitoquímica, ya que la reacción cruzada se puede ver fácilmente en el western blot.
En forma general para realizar la técnica Western Blot se deben llevar a cabo los siguientes pasos, los cuales se explicaran con mayor detalle (Ver figura 1)

  1. Preparación de la muestra
  2. Electroforesis
  3. Transferencia a una membrana
  4. Inmunotinción
  5. Detección de las bandas

Figura 1. Pasos generales en el Western Blot. A. Electroforesis; B. Transferencia; C. Inmunotinción; D. Detección de bandas

1. Preparación de la muestra

Una adecuada preparación de la muestra es esencial para tener éxito en un ensayo de Western Blot. En la mayoría de los ensayos, las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o mecánicos. El método elegido dependerá del tipo de muestra de partida, de la localización subcelular de la proteína y de las condiciones óptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el epítopo proteico.
En los procesos de lisis químicas, se suelen utilizar detergentes. La estructura química de estos permite romper las membranas celulares y solubilizar las proteínas. Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se pueden clasificar según las características del grupo polar: iónicos si el grupo polar tiene carga positiva o negativa, no iónicos si no poseen carga o zwiteriónicos si poseen carga neta de cero. La elección del detergente, depende en parte de la localización de la proteína de interés dentro de la célula (Tabla 1): citoplasmática, unida a la membrana, dentro de orgánulos celulares. etc.

Tabla 1. Soluciones Tampón y detergentes, según el tipo de proteína de interés y la localización subcelular
Tipo/Localización Proteína de interés Detergente o Solución Tampón Comentarios
Nativa
(no desnaturalizada)		 Detergente suave no iónico Evitar detergentes desnaturalizantes (SDS, Deoxicolatos)
Citoplasmáticos
(soluble)		 Tris-HCl Puede combinarse con métodos mecánicos
Citoplasmático
(unida a citoesqueleto)		 Tris-Tritón Los detergentes Tritón son suaves y no iónicos
Membrana mitocondrial o nuclear NP-40, RIPA (multiples detergentes), Triton X-100 Para antígenos con niveles bajos de expresión pueden ser necesarios procesos de enriquecimiento

Con la ruptura celular, se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la proteína de interés. Por tanto, es importante evitar, durante la preparación de la muestra, cualquier actividad de degradación. Para evitar este problema, todo el proceso se realiza en frio (+4°C) con la adición de inhibidores de proteasas al tampón, para inhibir dichas enzimas que pueden afectar su muestra.
El paso final de la preparación de la muestra es la reducción y la desnaturalización, que rompe las estructuras de los niveles superiores de organización para que las proteínas se puedan separar en la electroforesis. Esto se hace mediante la adición de un tampón que contiene un agente reductor, así como detergente y el calentamiento.
Para reducir y desnaturalizar las proteínas el tampón de muestra contiene dos agentes: dodecilsulfato de sodio (SDS) y beta-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT). El SDS es un agente desnaturalizante que ayuda a descomponer la proteína en su estructura de aminoácidos, y también recubre la proteína con cargas negativas en una proporción de masa uniforme. Esta relación uniforme de cargas negativas será esencial durante el siguiente paso del procedimiento, la electroforesis en gel. El beta-mercaptoetanol y el DTT son agentes reductores que rompen sus enlaces sulfuro, y también descomponen la proteína en una estructura lineal de aminoácidos primarios (Figura 2). Como nota al margen, en ocasiones la proteína de interés no debe ser reducida o no desnaturalizada, a menudo porque un anticuerpo particular solo reconoce esta forma de la proteína. Por lo tanto, los pasos de reducción y desnaturalización se pueden omitir, si es necesario, pero la mayoría de las transferencias Western se realizan en condiciones desnaturalizadas. Así que una vez que las muestras están preparadas adecuadamente, están listas para la electroforesis en gel.
Figura 2. A. Estructura de proteína nativa en ausencia de SDS y B-mercaptoetanol. B. Estructura de proteína en presencia de SDS y B-mercaptoetanol, sin estructura y cargada negativamente

2. Electroforesis

El tipo de electroforesis más comúnmente usado en Western Blot es el abreviado SDS-PAGE. SDS es el agente desnaturalizante que se agrega al tampón durante este procedimiento. PAGE significa electroforesis en gel de poliacrilamida, ya que los geles están típicamente hechos de acrilamida polimerizada.
Los geles están hechos de acrilamida polimerizada y reticulados por Bis en presencia de persulfato de amonio y TEMED. La estructura del gel puede controlarse alterando el porcentaje de acrilamida. Básicamente, al aumentar el porcentaje total de acrilamida, los poros de la matriz del gel se vuelven más estrechos y viceversa, un porcentaje de acrilamida más bajo resulta en poros más grandes de la matriz del gel. También hay geles de gradiente que consisten en capas de diferentes porcentajes de acrilamida, de modo que las proteínas pequeñas y grandes se puedan ejecutar de manera eficiente en los mismos geles. Este último gel es útil si se está analizando una gran variedad de proteínas en la misma transferencia.
En ocasiones hay anticuerpos, que reconocen no solo una secuencia definida de la proteína, sino también, la configuración que esta tiene en el espacio. En tal caso, en la electroforesis no se añadirá SDS ni en el gel ni en el tampón de muestra. En esta situación, también conocida como PAGE nativo, las proteínas mantienen su estructura tridimensional y la migración en el gel depende de su relación masa: carga de la proteína por encima de su tamaño. Sin embargo, la mayoría de ensayos Western Blot, se realizan en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes. Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de reducción, las proteínas cargadas negativamente, cuando se someten a un campo eléctrico, migran al electrodo positivo. Debido a que el SDS iguala la carga en todas las proteínas, la tasa de migración viene determinada por su peso molecular. Las moléculas más pequeñas migran más rápidamente que aquellas con pesos moleculares mayores.
Previamente a la electroforesis, es importante determinar la concentración de proteínas para asegurar cargar la cantidad correcta de proteínas en el gel. Existen diversos métodos para medir la proteína total de una muestra. Los más habituales son los métodos Lowry y Bradford. Estos ensayos colorimétricos se basan en las reacciones que se producen entre las proteínas de la muestra y los reactivos de detección.
Las muestras se cargan en los pocillos del gel mediante una pipeta. Normalmente se cargan de 20 a 40 µg de proteína total por carril. Es importante conocer de antemano, el volumen que se puede cargar por pocillo, para así evitar sobrecargas que pueden dar lugar a la pérdida de muestra o derrames en pocillos adyacentes. Una vez finalizada la carga, el gel se somete a un campo eléctrico generado por una fuente de alimentación. El tampón utilizado durante la electroforesis, contiene Tris (mantiene el pH), Glicina (conductor electricidad) y SDS (mantiene las proteínas cargadas negativamente). El progreso en el gel se monitoriza observando el frente coloreado por el colorante presente en el tampón de carga y la posición de los marcadores de tamaño siempre que estos estén teñidos (Figura 3).
Figura 3. Montaje para realizar electroforesis en condiciones desnaturalizantes

En conjunto con la corrida electroforética de las muestras es importante diseñar el experimento incorporando los controles y estándares necesarios para la validación de los resultados. Los tipos de estándares y controles utilizados incluyen:

Marcadores de Peso Molecular:

Son una mezcla de proteínas purificadas de peso molecular conocido, que se utilizan para verificar si la proteína de interés está dentro del rango de tamaño apropiado. Están disponible en diversos intervalos de pesos moleculares, así como teñidos o incoloros. Las versiones pre-teñidas se utilizan para controlar el progreso de la electroforesis y comprobar la eficacia de la posterior transferencia

Controles Positivos:

Con la finalidad de verificar si el anticuerpo primario se une a la proteína correcta, se carga una muestra de la proteína de interés purificada. Puede ser también una línea celular o una muestra de tejido del que se conozca que expresa altos niveles de la proteína de interés. Se pueden utilizar otras especies como tejido de control si el anticuerpo tiene reactividad cruzada apropiada.

Controles negativos:

En este tipo de control el anticuerpo primario no debe reaccionar ni emitir señal ya que las muestras no contienen la proteína de interés. Podría ser una muestra knockout, tejidos o células que no expresan la proteína de interés. De esta forma se confirma que no hay reacción cruzada.

Control de carga:

se usa a menudo durante la transferencia Western y es un anticuerpo que se usa además del anticuerpo primario dirigido contra la proteína de interés. El control de carga apunta a una proteína común que las muestras deben contener en aproximadamente la misma proporción. De modo que suponiendo que la misma cantidad de proteína de cada muestra se cargó correctamente en el gel durante la electroforesis, deberían haber bandas de tamaño similar del objetivo de control de carga. Si hubo un error durante la carga, la banda de control mostrará este error.

3. Transferencia

El siguiente paso después de la electroforesis en gel es la transferencia de proteínas a otra superficie. Esto se debe a que los geles son un sustrato pobre para la inmunodetección y debido a la fragilidad de los mismo pueden romperse fácilmente. Por lo tanto, se realiza la transferencia la proteína a una membrana más duradera para la posterior inmunotinción. La membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las proteínas, permitiendo así la detección de un anticuerpo.
El principio de la transferencia es similar a la electroforesis, ya que se “transfiere” del gel las proteínas cargadas negativamente hacia un polo positivo dentro de un campo eléctrico. Para esto el gel se coloca adyacente a una membrana porosa, y este sándwich de membrana y gel se agrega a un casete de transferencia con la membrana más cercana al polo positivo. Es importante tener cuidado de evitar las burbujas de aire entre el gel y la membrana, ya que el aire es un aislante y no conduce una corriente, por lo que las proteínas no se transfieren a través de la burbuja (figura 4). También se debe evitar la manipulación de las membranas con las manos desnudas ya que las proteínas y aceites de la piel pueden adherirse a la membrana y pueden dar lugar a manchas no deseadas en la membrana.
Figura 4. Montaje de transferencia a membrana

Adicionalmente, hay que tener en consideración los diferentes tipos de membranas disponibles, comúnmente PVDF o nitrocelulosa. Cada una tiene diferentes características. La membrana de PVDF, ofrece una mayor resistencia mecánica, resistencia la SDS y una mayor unión que la nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa tiene la ventaja de proporcionar un menor ruido de fondo y que no requieren un pretratamiento con metanol. Recientemente se han desarrollado, con el objetivo de reducir el ruido de fondo al utilizar métodos de detección de fluorescencia, membranas PVDF de baja autofluorescencia.

4. Inmunotinción

Se podría usar una tinción de proteínas como Coomassie en un gel o Ponceau en la membrana, pero son tinciones no específicas y mostrarán todas las proteínas de la muestra (figura 5A). Es muy difícil saber qué proteína es la de interés, y sería aún más difícil intentar comparar la cantidad de esa proteína entre las muestras. Por lo tanto, se usan anticuerpos específicos para que solo se visualice la proteína diana (figura 5B).
Figura 5. A. Detección de proteínas utilizando tinción Ponceau. B. Detección de proteína utilizando anticuerpo especifico

El primer paso en el procedimiento de inmunotinción es bloquear el espacio vacío en la membrana con una proteína neutral. Esto es importante porque la membrana es una superficie adherente para todas las proteínas, por lo que un anticuerpo libre podría unirse no específicamente a la membrana expuesta. Para esto se incuba con una solución diseñada para reducir los lugares de unión no específicos al anticuerpo. A menudo, son soluciones a base de proteínas, como la leche descremada en polvo o la albúmina de suero bovino (BSA). Las proteínas en la leche o el BSA se unen a la membrana para cubrir los espacios libres, para que el anticuerpo no se adhiera a estas áreas más adelante. La membrana debe colocarse en un agitador durante 1 hora, o durante la noche a 4 ° C.
Después del proceso de bloqueo, la membrana se incuba con el anticuerpo primario, se pueden utilizar, tanto anticuerpos primarios monoclonales como policlonales. En general, los anticuerpos reconocen una secuencia de aminoácidos (epítopo) que queda expuesta al eliminar la estructura tridimensional de la proteína en condiciones desnaturalizantes y reductoras. Los geles nativos se pueden utilizar cuando los anticuerpos requieren la proteína plegada para el reconocimiento del antígeno.
Generalmente, un periodo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente suele ser suficiente, pero también es posible una incubación a 4ºC durante toda la noche. En el proceso de incubación, la membrana debe someterse a agitación suave y sumergida en la disolución, para garantizar la adecuada distribución del anticuerpo.
Una vez que el anticuerpo se ha unido, la membrana debe lavarse para eliminar cualquier anticuerpo residual. Entre 3-5 lavados con TBST es suficiente durante aproximadamente 10 minutos cada lavado.
Después de retirar el anticuerpo primario, la membrana se tratará con el anticuerpo secundario que se conjuga con una molécula que se puede visualizar fácilmente durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario será específico para el anticuerpo primario, por lo que se une solo a este y, por lo tanto, se detecta a la proteína de interés.
Nuevamente, se debe lavar la membrana a fondo para eliminar el anticuerpo secundario residual. 3-5 veces con TBST durante unos 10 minutos es suficiente. Una vez que se lava la membrana, está lista para detectar la proteína a través de la molécula conjugada con el anticuerpo secundario.

5. Detección

La detección de la proteína se puede hacer mediante métodos directos o indirectos, cada uno con sus ventajas e inconvenientes. Los métodos directos utilizan un anticuerpo primario conjugado con un marcaje detectable, como una enzima, biotina o molécula fluorescente. Lo métodos indirectos utilizan dos anticuerpos; un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario contra la especie del primer anticuerpo. En la detección indirecta, es el anticuerpo secundario el que está conjugado con un marcaje detectable. Esta última es la forma más utilizada debido a la amplificación de la señal que produce.
Hay tres tipos de detección que se usan comúnmente en el Western Blot, quimioluminiscencia, fluorescencia y colorimetría (figura 6)

  • Quimioluminiscencia: Los métodos de detección de quimioluminiscencia utilizan comúnmente anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP). La reacción entre el enzima cataliza una reacción con un sustrato para producir una señal luminiscente que se captura en la película o captada de forma digital utilizando una cámara CCD.
  • Fluorescencia: El anticuerpo secundario se une a un fluoróforo, que cuando es excitad emite luz. La luz emitida, se detecta mediante un dispositivo capaz de medir la fluorescencia o mediante una cámara CCD provista con los filtros de longitud de onda apropiada. La imagen se digitaliza para su análisis.
  • Colorimetría: Los métodos colorimétricos utilizan un anticuerpo secundario que ha sido conjugado previamente a un enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina). La reacción de la enzima con el sustrato produce un producto insoluble que es visible en la membrana. La cantidad de colorante convertido es proporcional a la cantidad en la muestra. La intensidad de la tinción puede ser medida por espectrofotometría o por un densitómetro.

Figura 6. Esquema de detección de bandas por métodos colorimétricos, fluorimetricos o luminicentes

En una nota final, es importante reiterar lo importante que es comprender realmente la bioquímica de la proteína de interés, ya que la transferencia de Western depende en gran medida de este conocimiento. Cada mancha no necesariamente le dará una banda en el peso molecular esperado, pero esto no es necesariamente un motivo de preocupación. Puede haber habido modificaciones post-traduccionales o eventos de escisión, que causan que la proteína se ejecute en un tamaño diferente, o la muestra puede expresar una isoforma particular de la proteína. A través de bases de datos libres o la literatura disponible es posible obtener más información acerca del objetivo de esta forma se asegura de llevar a cabo de forma correcta cada uno de los pasos descritos anteriormente.



 Carlos Torrealba

  Asesor Científico