• Elegir una Proteína Fluorescente

octubre 30, 2019 71 Comentarios

En esta revisión encontrará todo lo que necesita saber para elegir la mejor proteína fluorescente para imágenes biológicas.
Desde que el gen original de la proteína verde fluorescente (GFP) se clonó en 1992, ha habido una explosión en la variedad de proteínas fluorescentes (PF) disponibles. Pueden fusionarse con una proteína en células o animales transgénicos, conjugarse con un anticuerpo o incluso usarse como sustrato en reacciones enzimáticas. Antes de seleccionar una proteína fluorescente para cualquiera de estas aplicaciones, hay una serie de consideraciones clave a tener en cuenta:

Proteína Fusión Consideración
Fusión C-terminal VS. N-terminal Pruebe ambos si es posible; Las proteínas de fusión C-terminales son generalmente mejores. Confirmar localización con un anticuerpo.
Excitación y Emisión Asegúrese de tener láseres correctos para excitar, y que los picos de emisión no se superpongan.
Brillo Seleccione la PF más brillante que también cumpla con sus requisitos experimentales.
Maduración Seleccione una maduración corta para eventos rápidos/sensibles en el tiempo.
Blanqueamiento Elija una PF con una alta fotoestabilidad para experimentos con una larga duración.
Condiciones Ambientales Asegúrese de que el pH, la temperatura y el oxígeno estén optimizados para su PF.
Optimización de Codones Compruebe que la secuencia de codones de su PF está optimizada/adecuada para su especie, especialmente cuando se usan plásmidos más antiguos.
Oligomerización En general, intente usar una PF monomérica.

Para ver las propiedades de algunas de las proteínas fluorescentes más populares, eche un vistazo a la tarjeta de referencia rápida de Abcam.

Figura 1. Espectro de Emisión.


C vs N: ¿qué terminal?

Si elige fusionar su PF al terminal C o N de su proteína de interés, la elección de cuál extremo usar dependerá en gran medida de la proteína en sí misma. Se debe evaluar cómo se pliega y si el extremo que elija tiene un requisito funcional o no. Por ejemplo, si el extremo C-terminal está plegado dentro de la proteína, es poco probable que reciba ninguna señal de la PF; o si su proteína se escinde postraduccionalmente en el extremo al que se fusiona su PF, entonces su PF se eliminará de su proteína de interés.
Si tiene los recursos o si su experimento es novedoso, podría ser mejor clonar ambos extremos con etiquetas C y N terminales para determinar la mejor opción. Un grupo de investigación descubrió que más proteínas de fusión C-terminales se localizan en el compartimento subcelular previsto que las proteínas de fusión N-terminal. Sin embargo, es importante enfatizar que, si bien las proteínas marcadas con C-terminal tienden a localizarse y comportarse como se espera, esto no siempre es posible de predecir.
Debe confirmar la localización de la proteína de fusión utilizando un anticuerpo contra la proteína nativa. Se puede emplear inmunofluorescencia verificar que la proteína de fusión se localice correctamente; una inmunotransferencia le ayudará a confirmar que la proteína de fusión tenga el tamaño correcto y se exprese a los niveles esperados; y la coinmunoprecipitación puede ayudar a evaluar cómo interactúa la proteína de fusión con sustratos conocidos.

Excitación, Emisión y Brillo

Si planea usar múltiples PF, es importante elegir una PF con picos de emisión distintos, así como picos de excitación a los que pueda apuntar con sus láseres disponibles. Si los picos de emisión se superponen, será difícil, o posiblemente imposible, diferenciarlos.
Por lo general, se desea la PF más brillante dentro de sus espectros disponibles para lograr una señal clara y superar cualquier posible fluorescencia de fondo. Los valores de brillo son un producto del coeficiente de extinción de la proteína y el rendimiento cuántico. Sin embargo, el número resultante puede ser difícil de interpretar, por lo que el brillo de una PF en relación con una PF bien definida como EGFP es una medida alternativa común.

Maduración y Blanqueo

La maduración define cuánto tiempo lleva plegarse correctamente una PF, formar el cromóforo y comenzar a fluorescer. Para eventos sensibles al tiempo en células vivas, un tiempo de maduración corto puede ser importante. Superfolder GFP (sfGFP), por ejemplo, puede plegarse en menos de 10 minutos, mientras que mOrange2 puede tomar más de cuatro horas.
El blanqueamiento es una medida de la fotoestabilidad, es decir, cuánto tiempo después de la excitación el cromóforo pierde la capacidad de emitir luz. Si planea realizar largos experimentos de lapso de tiempo, considere una PF con una alta fotoestabilidad. El zafiro T tiene una vida media de blanqueo (t½; tiempo para que una tasa de emisión inicial de x fotones/s se reduzca a la mitad) de 25 segundos, pero EGFP es mucho más estable, con un t½ de blanqueo de 174 segundos.

Condiciones Ambientales

Como la mayoría de las proteínas, las PF se ven afectados por el pH, la temperatura y los niveles de oxígeno. Dependiendo del entorno en el que planee usar su PF, es posible que necesite ajustar ligeramente las condiciones o seleccionar una PF más apropiada.
El pH puede afectar los picos de excitación y emisión, y la mayoría de las PF son sensibles al ácido. Algunas PF pueden cambiar la intensidad fluorescente con los cambios de pH. El valor de pKa es un buen indicador de la sensibilidad al pH: muestra el pH al que la mitad de los cromóforos son fluorescentes.
Los niveles de temperatura y oxígeno afectan los tiempos de maduración: las condiciones hipóxicas tienden a retrasar los tiempos de maduración, al igual que las temperaturas fuera del rango óptimo de las PF (por ejemplo, EGFP ha sido optimizado para trabajar a 37°C). Sin embargo, las PF más nuevas como UnaG, una GFP aislada de la anguila japonesa de agua dulce (Anguilla japonica), fluoresce incluso cuando los niveles de oxígeno son bajos.

Optimización de Codones

Como la mayoría de las PF se derivan de las medusas o las proteínas de coral, en lugar de células y/o tejidos de mamíferos en los que es probable que los use, puede haber una diferencia entre especies en los codones de aminoácidos utilizados. Esto puede conducir a una pobre expresión de la PF y, por lo tanto, baja señal.
Afortunadamente, muchas de las versiones más nuevas de las PF se han optimizado con codones para reflejar las preferencias de las células de mamíferos. En GFP, por ejemplo, Jürgen Haas y sus colegas mejoraron la señal entre 40 y 120 veces modificando la secuencia del codón GFP. Si está utilizando un plásmido más antiguo para generar sus proteínas de fusión, es posible que no contenga una secuencia modificada para la PF. Verifique si su secuencia de la PF se ha modificado para usar en una especie determinada.

Oligomerización

Es importante determinar si su PF es un monómero o dímero (los monómeros generalmente se denotan con una "m" que antepone el nombre de la proteína, por ejemplo, mCherry), y si esto afecta o no a su experimento. Muchos de las primeras PF eran propensas a formar oligómeros, y la oligomerización puede afectar la función biológica de la proteína de fusión. EGFP, por ejemplo, es un monómero que puede formar dímeros cuando se usa en concentraciones suficientemente altas, lo que puede distorsionar los orgánulos subcelulares o interrumpir experimentos.


Adaptación del artículo original publicado en la web de abcam


Fabiola Mejias

 Fabiola Mejias

  Representante de Allscience



71 Respuestas

vKVzcbkW
vKVzcbkW

enero 06, 2020

veZsukDtym

kqzJaGnsDch
kqzJaGnsDch

enero 06, 2020

ZxnuBkwe

ArIeVjvxTpzfd
ArIeVjvxTpzfd

enero 05, 2020

osEjMYBTzFIrG

doFYiLQmZljaeUtw
doFYiLQmZljaeUtw

enero 05, 2020

vOfDbwqmBGenFY

bOqmFZQjEfH
bOqmFZQjEfH

diciembre 27, 2019

VjJLzOBPbUAMEr

tbABDYXS
tbABDYXS

diciembre 26, 2019

zQsjKqtBrhwPkMbe

GkHjYKcqEgOSMuV
GkHjYKcqEgOSMuV

diciembre 26, 2019

KpvebtDSYq

mrTMlbaHCB
mrTMlbaHCB

diciembre 24, 2019

YfvypwcRFZ

CoyRlvZMec
CoyRlvZMec

diciembre 24, 2019

oLjyeSucsFGEB

kpxXyetNcUGr
kpxXyetNcUGr

diciembre 24, 2019

IXhzFgLpA

ZyJxTdgCFqrVGQoa
ZyJxTdgCFqrVGQoa

diciembre 24, 2019

icWSNBbxQuIh

jiohUZrTxyF
jiohUZrTxyF

diciembre 23, 2019

NxGHymbaljFQr

jZLuDzJxQp
jZLuDzJxQp

diciembre 20, 2019

owdsDhcpaUXjvnNI

ipYzCatfWQsoALd
ipYzCatfWQsoALd

diciembre 20, 2019

hdWFuAzGeIfT

JtuXIfSd
JtuXIfSd

diciembre 18, 2019

hoLWROljKIcT

DUXoKbyi
DUXoKbyi

diciembre 18, 2019

GHdXkNDaWIsp

RuyCLAiS
RuyCLAiS

diciembre 16, 2019

LfgykECdu

ODLuBbmfQM
ODLuBbmfQM

diciembre 16, 2019

WVeEpFocx

xqgdGZKkJiyRcXu
xqgdGZKkJiyRcXu

diciembre 15, 2019

rzEseiAdaRYWQOTx

OrLnzwCaWGQDUXtF
OrLnzwCaWGQDUXtF

diciembre 15, 2019

eUdPKZqbGOBgcWH

ZHiyYCSdWpbG
ZHiyYCSdWpbG

diciembre 14, 2019

kPCMNgpI

cfwSOUCFdmLYl
cfwSOUCFdmLYl

diciembre 14, 2019

LEtlboXQ

znLvUQPjZqMHsGlE
znLvUQPjZqMHsGlE

diciembre 13, 2019

tNhTqgALoinOCdIQ

bnmPwhEUpNFzVc
bnmPwhEUpNFzVc

diciembre 11, 2019

GDRtMripbJ

clMgYpxuwJtUKVSF
clMgYpxuwJtUKVSF

diciembre 11, 2019

rqdspuho

vUKJZNFdcDY
vUKJZNFdcDY

diciembre 11, 2019

MoBNyUEVepFj

vSqNghTCJlrOERU
vSqNghTCJlrOERU

diciembre 11, 2019

gxjRHtdQrUELBJiX

xsWTjrzckH
xsWTjrzckH

diciembre 11, 2019

hvYVEcqSNm

jldwBEaeAquYMsp
jldwBEaeAquYMsp

diciembre 11, 2019

SGJCWRhgaFxAP

lnORsvgkuNCA
lnORsvgkuNCA

diciembre 11, 2019

eYlyEiQHmqXbRM

hbqDwGyXuZjUxg
hbqDwGyXuZjUxg

diciembre 09, 2019

lnHmDdZWNQLkJRiP

sDjYOVHLdfGEMBio
sDjYOVHLdfGEMBio

diciembre 09, 2019

iJNDSqsMOFybURPW

ouQxegVXwrND
ouQxegVXwrND

diciembre 03, 2019

gkbtBQlFLOIw

PWFbKsREeChtLfY
PWFbKsREeChtLfY

diciembre 03, 2019

aKsvurEJtZq

VChEtNOmrpXaskQA
VChEtNOmrpXaskQA

diciembre 03, 2019

RrEGnhiVKjpzs

BYWqalQmNT
BYWqalQmNT

diciembre 03, 2019

HpzbCanJ

SAWpQOXvVruwm
SAWpQOXvVruwm

diciembre 03, 2019

wkNmEbgjSH

eWwGSlFkmhpVCv
eWwGSlFkmhpVCv

diciembre 02, 2019

CWXHFaDoExkjNV

XlEYrNsWCcwJeV
XlEYrNsWCcwJeV

diciembre 02, 2019

mftxGhcIwXiJUW

JQBTRDyC
JQBTRDyC

diciembre 02, 2019

UnIcACwT

VKNmuJStegnjfPc
VKNmuJStegnjfPc

diciembre 02, 2019

DkfSBwPTuRjEtN

NCScEBitRWx
NCScEBitRWx

diciembre 01, 2019

dYDiNkTfFoIeVQn

FgMvwBiYP
FgMvwBiYP

diciembre 01, 2019

gSudaNef

HhMiYJQPo
HhMiYJQPo

diciembre 01, 2019

qvoUTpFE

TIRzZFQgujmnfCrV
TIRzZFQgujmnfCrV

noviembre 29, 2019

doQvRGzlEcMna

ztALhqUIoDbueyHK
ztALhqUIoDbueyHK

noviembre 29, 2019

hBvIwktzTEJn

ICMKJpVscDf
ICMKJpVscDf

noviembre 29, 2019

GFnthjaZ

uvZRjysbz
uvZRjysbz

noviembre 29, 2019

etrXOPSyMhUWBlgc

iqghDLzj
iqghDLzj

noviembre 28, 2019

MpPwFEzKkAvQ

zpmMSifEwZIVd
zpmMSifEwZIVd

noviembre 28, 2019

vyLFdOXitbp

FctENDGHbOQ
FctENDGHbOQ

noviembre 28, 2019

zHTeBjaDEKxIpUh

wWsgzUIPty
wWsgzUIPty

noviembre 28, 2019

UusmzxyQ

eGPLABpKVyN
eGPLABpKVyN

noviembre 27, 2019

XkJcxmTFKDflzwIn

zDeacmoMu
zDeacmoMu

noviembre 27, 2019

QlrMdyvTDqPhj

kCUMQlXyZWArKGHd
kCUMQlXyZWArKGHd

noviembre 27, 2019

dhWjanLp

RvKQpUPTtyC
RvKQpUPTtyC

noviembre 27, 2019

RzLltHaWexK

LrhyjbIeVMO
LrhyjbIeVMO

noviembre 26, 2019

QpvClETuLijkRUF

DrxWweTtnMzRvm
DrxWweTtnMzRvm

noviembre 25, 2019

kYXsniuUAwJQyfD

hdzRXpwUObxNHfkm
hdzRXpwUObxNHfkm

noviembre 25, 2019

INyrLYhXEOCn

xkcnBJaIlejYX
xkcnBJaIlejYX

noviembre 25, 2019

UBfDreswzMNu

ZvNEUGBp
ZvNEUGBp

noviembre 25, 2019

tRPOrBdYgZa

ixeJySGTPlqcI
ixeJySGTPlqcI

noviembre 23, 2019

ldFDeSHGorThWAO

giXMDUmkRvHwJs
giXMDUmkRvHwJs

noviembre 23, 2019

jKmqHiVoPTsCp

TveXOCnHStUxo
TveXOCnHStUxo

noviembre 23, 2019

cCBAsJYFXDMThlvE

ZSvsEdfILgp
ZSvsEdfILgp

noviembre 23, 2019

gDEujYaGiv

eYnNWBiuPtm
eYnNWBiuPtm

noviembre 21, 2019

MsfIvTmY

GBYPugDk
GBYPugDk

noviembre 21, 2019

FAhvHTqU

cDJzuKpLUrtgEPXq
cDJzuKpLUrtgEPXq

noviembre 19, 2019

zQCslXwI

SMBzaOJFlbdmWkTE
SMBzaOJFlbdmWkTE

noviembre 19, 2019

GnRuMcWlmxO

ubSDvzlNMQReifU
ubSDvzlNMQReifU

noviembre 07, 2019

ExlOIPvSYMFwpKu

JiuhaTIL
JiuhaTIL

noviembre 07, 2019

lgfnomydk

Dejar un comentario


Ver artículo completo

CRISPR-Cas 9: ¿Qué es? ¿Cómo funciona? ¿Qué aplicaciones tiene? y ¿por qué es una técnica tan revolucionaria y controversial a la vez?
CRISPR-Cas 9: ¿Qué es? ¿Cómo funciona? ¿Qué aplicaciones tiene? y ¿por qué es una técnica tan revolucionaria y controversial a la vez?

noviembre 06, 2019 75 Comentarios

En la película Gattaca, del ya le lejano año 1997, se ilustraba una sociedad futura en la cual  la mayor parte de los niños eran concebidos in vitro y con técnicas de selección genética que permitían a los padres “diseñar” su progenie de manera que estos contaran con todas las características deseables de ambos progenitores y sin ninguna que pudiera ser perjudicial, incluyendo enfermedades con compontes hereditarios como el asma...

Ver artículo completo

¿Cuáles son las mejores apps para avanzar en tu proyecto de investigación?
¿Cuáles son las mejores apps para avanzar en tu proyecto de investigación?

septiembre 10, 2019 76 Comentarios

La vida en el laboratorio puede ser muy acelerada, con poco tiempo entre incubaciones para prepararse para la siguiente etapa de un experimento, pero afortunadamente vivimos en una era de soluciones digitales...

Ver artículo completo

Introducción a Western Blot
Introducción a Western Blot

junio 28, 2019

Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Este método permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. Este método permite la detección de...

Ver artículo completo