• ¿Cuales son las diferencias entre PCR, RT PCR, qPCR y RT qPCR?

mayo 24, 2017

Figura 1. Una electroforesis en gel, la cual puede utilizarse para determinar el tamaño de las moléculas de DNA

 

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es  una técnica relativamente simple y ampliamente utilizada en el campo de la biología molecular para amplificar y detectar secuencias de DNA y RNA. Comparada con los métodos tradicionales de amplificación y clonación de DNA, los cuales a menudo toman días, la PCR requiere solo unas pocas horas. La PCR es altamente sensible y requiere una plantilla mínima para la detección y amplificación de secuencias específicas. Lo métodos básicos de PCR han tenido grandes avances y hoy en día se puede hacer mucho más que simplemente amplificar fragmentos de DNA o RNA. A continuación se presenta un breve resumen de los principales tipos de PCR y sus diferencias.

 

PCR

Para  la PCR convencional solo se necesita una DNA polimerasa, magnesio, nucleótidos, primers, el DNA molde que se desea amplificar y un termociclador. El mecanismo de la PCR es tan simple como su propósito: 1) El DNA doble cadena (dsDNA) es desnaturalizado (separado en cadenas sencillas) por calor. 2) Los primers se unen a las secuencias compatibles en el DNA cadena sencilla. 3) Los primers son extendidos por la DNA polimerasa (en dirección 5’ – 3’), dando como resultado dos copias de la molécula original de DNA doble cadena. Estas tres etapas comprenden un ciclo de amplificación en la PCR. Cada paso del ciclo debe ser ptimizado por el investigador de acuerdo al DNA molde y el set de primers utilizados. Este ciclo de amplificación se repite usualmente de 20 – 40 veces y el producto amplificado puede ser analizado. La PCR es muy utilizada para amplificar el DNA para su posterior uso en otros experimentos. Esta técnica también tiene aplicaciones en pruebas genéticas o para la detección de DNA patógeno.

Figura 2. Etapas de un ciclo de amplificación de PCR

 

Como la PCR es un método altamente sensible y requiere volúmenes de reacción muy pequeños, es recomendable la preparación de una mezcla maestra  (master mix) para varias reacciones. La mezcla maestra debe estar bien mezclada y debe dividirse por el número de reacciones, asegurando que cada reacción contenga la misma cantidad de enzima, dNTPs y cebadores (primers). Muchos proveedores ofrecen mezclas de PCR que ya contienen todo, excepto los primers y el DNA molde.

Las regiones con alto contenido de Guanina / citosina (GC) representan un desafío en técnicas de PCR convencional. Las secuencias ricas en GC son más estables que las secuencias con menor contenido de GC (la guanina y la citosina se unen mediante tres puentes de hidrógeno, mientras que la timina y la adenina se unen mediante dos puentes de hidrógeno). Además, las secuencias ricas en GC tienden a formar estructuras secundarias, tales como bucles. Como resultado, las cadenas dobles ricas en GC son difíciles de separar por completo durante la fase de desnaturalización. En consecuencia, la DNA polimerasa no puede sintetizar la nueva hebra sin impedimento alguno. Una temperatura de desnaturalización más alta puede mejorar esto y ajustes hacia una temperatura de unión más alta y un tiempo de unión más corto pueden evitar la unión inespecífica de primers ricos en GC. Ciertos reactivos adicionales pueden mejorar la amplificación de secuencias ricas en GC. El DMSO, el glicerol y la betaína ayudan a interrumpir las estructuras secundarias que son causadas por las interacciones GC y por lo tanto facilitan la separación de las hebras dobles.

 

Hot start PCR

La amplificación inespecífica es un problema que puede ocurrir durante la PCR. La mayoría de las DNA polimerasas que se utilizan para PCR, funcionan mejor a 68 - 72 ° C. Por lo tanto, la temperatura de extensión elegida debe estar en este rango. Sin embargo, la enzima puede ser también activa en menor grado, a temperaturas más bajas. A temperaturas que están muy por debajo de la temperatura de unión, los cebadores tienden a unirse en forma inespecífica, lo que puede conducir a una amplificación no específica del DNA molde. Esto se puede prevenir usando inhibidores de polimerasa que se disocian de esta sólo cuando se alcanza cierta temperatura. El inhibidor puede ser un anticuerpo que se une a la polimerasa y se desnaturaliza a la temperatura de desnaturalización inicial.

 

RT-PCR

La PCR de transcripción inversa o RT-PCR, permite el uso de RNA como molde. Un paso adicional permite la detección y amplificación del RNA. El RNA se transcribe de forma inversa en DNA complementario (cDNA) utilizando una transcriptasa inversa. La calidad y pureza del RNA molde es esencial para el éxito de la RT-PCR. El primer paso de la RT-PCR es la síntesis de un híbrido DNA / RNA. La transcriptasa inversa también tiene una función RNasa H, que degrada la porción de RNA del híbrido. La molécula de DNA de cadena sencilla restante sirve entonces como molde para la formación de cDNA, mediante la actividad DNA polimerasa dependiente de DNA, de la transcriptasa inversa. La eficiencia de la reacción de la primera cadena puede afectar al proceso de amplificación. A partir de aquí, se utiliza el procedimiento de PCR convencional para amplificar el cDNA. La posibilidad de revertir el RNA en cDNA por RT‑PCR tiene muchas ventajas. El RNA es monocatenario y muy inestable, lo que dificulta el trabajo con este material. Más comúnmente, sirve como un primer paso en qPCR, que cuantifica la cantidad de RNA que ha sido transcrito en una muestra biológica.

 

qPCR y RT-qPCR

 La PCR cuantitativa (qPCR) se utiliza para detectar, caracterizar y cuantificar ácidos nucleicos para numerosas aplicaciones. Comúnmente, en RT-qPCR, los transcritos de RNA se cuantifican por transcripción inversa en cDNA en primer lugar, como se describió en el párrafo anterior y luego se lleva a cabo la qPCR. Como en la PCR convencional, el DNA se amplifica mediante 3 pasos repetidos: desnaturalización del DNA doble cadena, unión de los primers al DNA cadena sencilla y alargamiento de las cadenas de DNA molde. Sin embargo, en la qPCR, el marcaje con compuestos fluorescentes permite la recopilación de datos a medida que la PCR avanza. Esta técnica tiene muchos beneficios debido a una gama de métodos y productos químicos disponibles.       
En la qPCR basada en un tinte (que típicamente es verde), el marcaje fluorescente permite la cuantificación de las moléculas de DNA amplificadas empleando el uso de un tinte de unión al DNA doble cadena. Durante cada ciclo, se mide la fluorescencia y la señal de fluorescencia aumenta proporcionalmente a la cantidad de DNA replicado, por lo cual, el DNA se cuantifica en "tiempo real". Las desventajas de la qPCR son que sólo se puede examinar un solo blanco (target) a la vez y que el colorante se unirá a cualquier DNA doble cadena presente en la muestra.
En la qPCR basada en sondas, se pueden detectar simultáneamente muchos blancos (targets) en cada muestra, pero esto requiere la optimización y el diseño de una sonda específica, usada además de los primers. Hay varios tipos de diseños de sonda disponibles, pero el tipo más común es una sonda de hidrólisis, que incorpora el uso de un fluoróforo y un extintor (quencher). La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) evita la emisión del fluoróforo a través del extintor mientras la sonda está intacta. Sin embargo, durante la reacción de PCR, la sonda se hidroliza durante la extensión del primers y la amplificación de la secuencia específica a la que está unida. La escisión de la sonda separa el fluoróforo del extintor y da como resultado un aumento de la fluorescencia dependiente de la amplificación. De este modo, la señal de fluorescencia de una reacción de qPCR basada en sonda es proporcional a la cantidad de la secuencia blanco de la sonda presente en la muestra. Debido a que la qPCR basada en sonda es más específica que la qPCR basada en tinte, esta es a menudo la tecnología utilizada en los ensayos de diagnóstico mediante qPCR.
En AllScience LLC podemos ofrecerte una gran variedad de opciones para llevar a cabo tu PCR de forma exitosa, ya sea una PCR convencional, una PCR de regiones ricas en GC, PCR en tiempo real, RT-PCR o cualquier otro tipo de PCR. No dudes en contactarnos y te ayudaremos a encontrar la mejor opción para llevar a cabo tu investigación.

Adaptación del artículo original de Sarah Neidler para Enzo Life Sciences

Mayo 2017, Iván León.

  Iván León

  Representante de Allscience



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