¿Cómo medir la actividad de las caspasas?

abril 15, 2014 1622 Comentarios

La apoptosis, o muerte celular programada, cuando se regula en exceso puede dar lugar a patologías como el Alzheimer; mientras que, si se regula muy poco, puede resultar en el crecimiento de un tumor. 

Un regulador importante de la apoptosis es una familia de 12 proteasas conocidas como caspasas. Algunas de ellas, conocidas como caspasas iniciadoras, ayudan a estimular la cascada de señalización de eventos de la apoptosis. Otras, llamadas caspasas efectoras, ejecutan las vías apoptóticas por sí solas.

Dada su participación en la apoptosis, las caspasas y sus actividades enzimáticas se utilizan a menudo como biomarcadores para este proceso. La mayoría de los ensayos de caspasa suelen ser fluorométricos, colorimétricos o basados en citometría, y vienen en kits fáciles de usar.

Ensayos de caspasa fluorométricos y colorimétricos


Los ensayos fluorométricos y colorimétricos utilizan la actividad enzimática de la caspasa, y un sustrato indicador especialmente diseñado para generar ya sea una señal fluorescente, de color, o a veces luminiscente, que puede ser leída por un escáner de microplacas, o fotografiada microscópicamente. 

Los ensayos fluorométricos son más sensibles, en promedio, de 10 a 100 veces más que los ensayos basados en colorimetría, y a veces tienen un rango de medición dinámica más amplio. Otra ventaja es que los ensayos fluorométricos tienden a tener fondo inferior, porque lo único que contribuye a que se produzca la señal es el fluoróforo liberado. 
No obstante, los ensayos de caspasa fluorométrica requieren instrumentación y materiales especializados, que pueden incurrir en costos adicionales. 

En los ensayos colorimétricos, la señal es un cambio visible en el color de la reacción. 

Ensayos de citometría de flujo de caspasas


Los ensayos de citometría de flujo proporcionan otro tipo de información que los fluorométricos y colorimétricos. Estos ensayos miden la caspasa celular, la actividad por célula, cómo las células pasan a través de un citómetro de flujo. Este enfoque es particularmente útil si se desea medir la proporción de células que están mostrando la actividad enzimática, por ejemplo, en respuesta a un tratamiento experimental específico. 

Estos ensayos también son útiles para el estudio de respuestas celulares individuales, en contraste con la respuesta promedio de todas las células. Otro beneficio es la capacidad de hacer mediciones múltiples por célula al mismo tiempo, por ejemplo, mediante el uso de diferentes sondas para la actividad de la caspasa y marcadores de muerte celular. 

Sin embargo, a pesar de que los ensayos de caspasa basados en el flujo pueden trabajar tanto con suspensión y tipos de células adherentes, a veces dichas células pueden iniciar respuestas tempranas de apoptosis. Otra desventaja potencial, es que las células necesitan ser permeabilizadas para la detección, por lo que es importante incluir controles adicionales para otros procesos como la necrosis, lo que hace que la membrana celular se vuelva permeable. 

De hecho, aunque la actividad de las caspasas es un indicador fiable de la apoptosis, no es una guía absoluta. Debido a ello, los ensayos de caspasa siempre deberían realizarse en conjunción con otros ensayos de apoptosis, tales como la exposición de fosfatidilserina o condensación de la cromatina, para demostrar la ausencia o presencia de otros procesos como la necrosis, la autofagia o senescencia.

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Fuente: Keep an Eye on Apoptosis with Caspase Assays



100 Respuestas

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